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Report Western Blotting實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介及答疑
Western Blotting
Western Blotting，即免疫印跡，是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測(cè)的基礎(chǔ)
上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)，它結(jié)合了SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的高
分辨率與抗原抗體反應(yīng)的特異性。
其基本原理是：通過(guò)電泳將蛋白組分分開(kāi)，然后將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)
移至載體膜上，用封閉試劑封閉載體膜上未吸附蛋白質(zhì)的區(qū)域，最后通過(guò)免疫學(xué)
檢測(cè)來(lái)分析特定的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進(jìn)行免疫學(xué)分析的弊
端，極大地提高了其分辨率和靈敏度，廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)特定基因表達(dá)產(chǎn)物的正
確性，或者比較表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)變化量。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，需準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和耗材，主要包括：各種凝膠配
置液、各種緩沖液、相關(guān)抗體、PVDF 膜，賽默飛公司的QSP 盒裝吸頭及Nunc
冰盒，芬蘭百得的各個(gè)量程單通道移液器等。
主要儀器有：Thermo Scientific 全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀、離心機(jī)、電泳
儀等。
接下來(lái)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)部分，本實(shí)驗(yàn)操作流程為：首先制備蛋白樣品，然后進(jìn)行
SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，接著
對(duì)含有蛋白質(zhì)的PVDF 膜進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)，X-膠片顯影定影后，掃描圖片，最
后用IPWIN6.0 軟件分析結(jié)果。
蛋白樣品的制備
按 1ml 裂解液加10 μl 的100mmol PMSF，混勻后置于冰上待用。注意：PMSF
要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合，PMSF 是劇毒物質(zhì)，操作時(shí)要謹(jǐn)慎。
蛋白樣品一般來(lái)源于基因工程菌或特定的真核細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)以單層貼壁細(xì)胞
總蛋白的提取為例。
倒掉離心管中的上清，用移液槍吸去殘余培養(yǎng)液，注意不要吸走細(xì)胞。
每管細(xì)胞加 400 μl 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂
解，要經(jīng)常上下顛倒離心管。
然后于4℃ 10000×g 離心力離心5min。
將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，分裝至少兩份，放于-80℃保
存。
蛋白質(zhì)定量：按 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，用Thermo
Scientific 全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀于波長(zhǎng)562nm 處檢測(cè)OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲
線并計(jì)算樣品蛋白濃度，取適量上清，加入上樣緩沖液，煮沸10min。緩慢恢復(fù)
至室溫后，稍離心，放于-20°C 保存。
SDS-PAGE 電泳
凝膠的制備
灌膠前，需組裝好制膠器，將洗凈且干燥的兩塊玻璃板底端對(duì)齊后安放在灌
膠支架上。
參照 12%分離膠配制體系依次加入各個(gè)組分，混勻。將配置好的凝膠，沿玻
璃板的一角小心緩慢注入，防止產(chǎn)生氣泡。根據(jù)梳子深度確定灌制高度，通常距
離矮板至少2cm，灌好后，注入水封膠。
此時(shí)可按照配方配制 5%濃縮膠，注意TEMED 在灌膠前再加入。
注意：AP 最好在配好一周內(nèi)使用，TEMED 避光保存，分離膠和濃縮膠的
Tris pH 值分別是8.8 和6.8。
靜置一段時(shí)間待凝膠聚合，凝膠聚合后，棄去封膠溶液，并用吸水紙吸干。
往濃縮膠里加入適量 TEMED，混勻后緩慢灌入到膠槽至矮板頂部，插上梳
子，操作時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。
靜置一段時(shí)間至凝膠聚合，拔下梳子，用蒸餾水沖洗膠孔。
此時(shí)制好的膠可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
上樣及電泳
安裝電泳槽，注意確保內(nèi)槽不漏緩沖液，往電泳槽加入足量電泳緩沖液，
緩沖液要沒(méi)過(guò)玻璃板和凝膠。
吸取適量樣品或者分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker，緩慢加入至膠孔。注意：加樣太快會(huì)
使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出；加入下一個(gè)樣品時(shí)，要注意更
換槍頭，以免交叉污染。
上樣完畢后，蓋上電泳槽蓋子，接通電源，設(shè)置電泳條件，一般濃縮膠15mA，
分離膠20mA，或恒壓100 -120V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可關(guān)閉電泳儀停止電
泳。
轉(zhuǎn)膜
將玻璃板從電泳槽中取出，用塑料切膠器在玻璃板的兩邊輕輕撬動(dòng)，至到小
玻璃板開(kāi)始松動(dòng)。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，注意不要把分離膠刮破。
將剝出的膠浸于純水中5min，重復(fù)三次后放在轉(zhuǎn)膜液中浸泡10min。
PVDF 膜預(yù)先用甲醇浸泡5min，然后將轉(zhuǎn)印膜、印跡濾紙和海綿墊浸泡于
轉(zhuǎn)移緩沖液中10min。膜和印跡濾紙的大小應(yīng)裁剪至與膠的大小相當(dāng)。在黑色面
板上放置一層海綿墊，并依次放置至少3 層印跡濾紙，凝膠，轉(zhuǎn)印膜和至少3
層印跡濾紙。放置膜時(shí)盡量一次性準(zhǔn)確放置，凝膠與轉(zhuǎn)印膜一旦接觸就不要再移
動(dòng)，并記住膜與膠的接觸面。玻璃試管輕輕滾壓濾紙擠出氣泡，并用海綿覆蓋。
關(guān)上轉(zhuǎn)印夾，合上鎖扣。安裝好的轉(zhuǎn)印夾應(yīng)該使膠緊密地與PVDF 膜接觸而不被
擠壓。
將組裝好的夾子裝入轉(zhuǎn)移電泳槽中，要使夾子的黑面對(duì)槽的黑面。添加電泳
緩沖液，蓋好蓋子，開(kāi)啟電泳儀，設(shè)置電泳條件，一般用200mA 1-2h，或用恒
壓100V 1-2h。注意：電泳轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，需要在電泳槽的一邊放一些冰來(lái)降溫。
轉(zhuǎn)膜完成后，就進(jìn)入免疫反應(yīng)。
免疫反應(yīng)
印跡后的 PVDF 膜用5%脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉１h，也可在4℃過(guò)夜。
將抗 Caspase 3 的鼠源單克隆抗體用一抗稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，室溫下孵
育PVDF 膜1-2h 后，用TBST 在室溫下脫色搖床上洗3 次，每次10min，再用
TBS 洗一次，10min。
將過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗或X GAPDH 抗體按照適當(dāng)比例用TBS 稀
釋，室溫下孵育PVDF 膜30min 至1h
用 TBST 于室溫下脫色搖床上洗3 次，每次10min；再用TBS 洗一次，10min。
ECL 化學(xué)發(fā)光與X 光片定影
加入顯色底物后按常規(guī)X光片顯影方法將轉(zhuǎn)印膜上的信號(hào)轉(zhuǎn)移至X光片上。
半定量結(jié)果分析
將定影后的 X 光片掃描保存為電腦文件，并用IPWIN 6.0 分析軟件對(duì)圖片
上每個(gè)特異條帶灰度值進(jìn)行數(shù)字化分析。具體操作如下：
打開(kāi) Image Pro Plus 軟件，點(diǎn)擊File，打開(kāi)結(jié)果圖片。
首先進(jìn)行光密度校對(duì)，點(diǎn)擊Measure，Calibration，點(diǎn)擊Intensity。在Intensity
Calibration 窗口中，點(diǎn)擊New，選中Std.Optical Density，點(diǎn)擊Optical，點(diǎn)擊Imax
ge，選擇圖中最亮的一點(diǎn)。然后點(diǎn)擊Ok，依次在新出現(xiàn)的對(duì)話框中點(diǎn)擊Ok，
System，然后關(guān)閉小對(duì)話框。
點(diǎn)擊 Measure，Count/Size，點(diǎn)擊Select Color，Color Cube Based，使用滴管
將要分析的條帶覆蓋成紅色，即AOI，關(guān)閉窗口。點(diǎn)擊Measure，Select Measure，
選擇Area 和IOD。在Count/Size 窗口中，點(diǎn)擊Options。Label Style 選擇
Measurement，可選擇將Area 或是IOD 的值顯示在各AOI 上。點(diǎn)擊Ok，點(diǎn)擊
Count，即得到各AOI 的IOD 值。點(diǎn)擊View，Measurement Data，可見(jiàn)每個(gè)AOI
對(duì)應(yīng)的面積和累積光密度值。在Statistics 窗口可查看面積和光密度的總值。
接下來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理：樣品中目的蛋白的IOD值除以內(nèi)參X GAPDH 的 IOD
值，所得結(jié)果代表某樣品目的蛋白的相對(duì)含量。
利用此軟件，可以對(duì)一系列的梯度條帶進(jìn)行數(shù)字化分析和處理，如內(nèi)參為X
GAPDH 的CXCR four 的分析，內(nèi)參為β-Actin 的Caspase 3 的分析等。
疑問(wèn)與解答
Doctor A，轉(zhuǎn)膜完畢，經(jīng)染色后發(fā)現(xiàn)蛋白條帶不是很清晰，請(qǐng)問(wèn)是什么原因？
這個(gè)問(wèn)題問(wèn)的很好，轉(zhuǎn)膜是 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)中很關(guān)鍵的一步，一般轉(zhuǎn)
膜不充分，我們從以下幾個(gè)方面來(lái)分析：首先，PVDF 膜可能沒(méi)有完全均勻濕透，
需要用100%甲醇浸泡約15min，從而活化PVDF 膜上的帶電基團(tuán)，提高其結(jié)合
蛋白的能力；其次，小于10KD 的靶蛋白容易穿透膜轉(zhuǎn)移至緩沖液中，應(yīng)選擇小
孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間；另外，轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與
SDS 分離，從而沉淀在凝膠中，降低其甲醇濃度或者使用乙醇、異丙醇等代替；
最后要注意轉(zhuǎn)移緩沖液中SDS 的濃度，是否加SDS 與目標(biāo)蛋白溶解性有很大關(guān)
系。一般來(lái)說(shuō)，疏水性很強(qiáng)的蛋白，比如分布于細(xì)胞膜上的蛋白，或者一些100KD
以上的蛋白也可能出現(xiàn)溶解性不足，由于其容易在凝膠里形成聚集沉淀，因此在
轉(zhuǎn)移緩沖液中加入終濃度為0.1%的SDS，以避免出現(xiàn)這種情況。但是對(duì)于小蛋
白，SDS 妨礙蛋白與膜的結(jié)合，這種情況下，轉(zhuǎn)移緩沖液中可以不加SDS。
實(shí)驗(yàn)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)膜后可以看到 Marker 條帶，可是在免疫反應(yīng)后卻沒(méi)有
陽(yáng)性條帶，請(qǐng)問(wèn)是什么原因？
答案已經(jīng)很明顯了，問(wèn)題是出在免疫反應(yīng)的步驟中，考慮以下兩點(diǎn)：首先，
抗體結(jié)合不充分，調(diào)整一抗和二抗的稀釋比例，延長(zhǎng)孵育時(shí)間；然后可能是顯色
體系的問(wèn)題，直接將酶標(biāo)二抗和底物進(jìn)行混合，如果不顯色，則需要更換新的酶
標(biāo)二抗或相應(yīng)顯色底物。
實(shí)驗(yàn)最后得到的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)背景很高，請(qǐng)問(wèn)怎樣改善實(shí)驗(yàn)操作，才能降低背
景顏色？
背景高也是很多初學(xué)者經(jīng)常遇到的問(wèn)題，具體的的原因及解決方法有如下幾
條：首先同樣是PVDF 膜沒(méi)有完全均勻濕透，使用100% 甲醇浸透膜；其次可
能是封閉不充分，選擇合適的封閉試劑，如：脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等，增加
封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度；第三，免疫反應(yīng)時(shí)洗膜不充分: 增加洗液體積
和洗滌次數(shù)；最后還要考慮是不是曝光過(guò)度，縮短曝光時(shí)間。
謝謝 Doctor A 的解答，還有最后一個(gè)問(wèn)題。Western Blotting 為什么必須使
用內(nèi)參,常用的內(nèi)參有哪些,具體怎么使用內(nèi)參？
在 Western Blotting 中使用內(nèi)參其實(shí)就是在此過(guò)程中應(yīng)用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢
測(cè)內(nèi)參的表達(dá)量，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣
品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用
內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)Western Blotting 發(fā)
光體系是否正常等。常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有X GAPDH 和細(xì)胞骨架蛋白β-Actin 或
β-tubulin。具體使用內(nèi)參的方法通常有以下兩種：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選
用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后，根據(jù)預(yù)染的蛋白
質(zhì)Marker 大小將膜剪為目的蛋白和內(nèi)參蛋白兩部分，然后兩塊膜分別與目的蛋
白抗體和內(nèi)參蛋白抗體進(jìn)行孵育以及顯色。另外一種是，當(dāng)目的蛋白的分子量大
小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體孵育顯
色和檢測(cè)，然后使用Strip 緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗
體溫育、顯色檢測(cè)。
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